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層析

[ 更新時間:2014-06-18 ]
     層析(chromatography)是“色層分析”的簡稱。利用各組分物理性質(zhì)的不同,將多組分混合物進(jìn)行分離及測定的方法。有吸附層析分配層析兩種。一般用于有機(jī)化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。層析利用物質(zhì)在固定相流動相之間不同的分配比例,達(dá)到分離目的的技術(shù)。層析對生物大分子如蛋白質(zhì)和核酸等復(fù)雜的有機(jī)物的混合物的分離分析有極高的分辨力。
 

1語源學(xué)編輯

chroma意為“色彩”,graphy源自希臘文,意為“寫”。色譜為層析的同義語,都是從英語chromatography譯來
的。
層析(色譜) chromatography
在把微細(xì)分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相,把液體(與上述液體不相混合的)或氣體作為移動相的系統(tǒng)中,使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動,利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動速度差,將它們彼此分離開的定性與定量分析方法,稱為層析,亦稱色譜法。根據(jù)移動相種類的不同,分為液體層析、氣體層析二種。用作固定相的有矽膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等,或是在硅藻土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當(dāng)?shù)囊后w,也可使用其他物質(zhì)。將作為固定相的微細(xì)粉末狀物質(zhì)裝入細(xì)長形圓筒中進(jìn)行的層析稱為柱層析(column chromatogra-phy),在玻璃板上涂上一層薄而均的物質(zhì)作為固定相的稱為薄層層析(thin-layer chromatography),后者可與用濾紙作為固定相的紙上層析進(jìn)行同樣的分析,即在固定相的一端,點(diǎn)上微量試料,在密閉容器中,使移動相(液體)從此端滲入,移動接近另一端。通過這種展開操作,各成分呈斑點(diǎn)狀移動到各自的位置上,再根據(jù)Rf值的測定進(jìn)行鑒定。當(dāng)斑點(diǎn)不易為肉眼觀察時,可利用適當(dāng)?shù)?a href=http://baike.baidu.com/view/1342816.htm target=_blank>顯色劑,或通過紫外燈下產(chǎn)生熒光的方法進(jìn)行觀察。也可采用在第一種移動相展開后再用另一移動相進(jìn)行展開(這時的展開方向應(yīng)與原方向垂直),使各成分分離完全的雙向?qū)游觯╰wo-dimensional chromatography)。分離后,將斑點(diǎn)位置的固定相切取下來,把其中含有來自試料的物質(zhì)提取進(jìn)行定量分析。但為制備與定量,柱層析則更為適宜。在柱層析中,移動相從加入試料的一端展開到達(dá)另一端后,繼續(xù)展開使各成分和移動相一起向柱外分別溶出,這就是廣泛使用的所謂洗提層析(elution chromatography)。層析根據(jù)固定相與溶質(zhì)(試料)間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型(離子交換層析)等三種類型。但這并不是很嚴(yán)格的,有時常見到其中間類型。此外,近來也應(yīng)用親和層析,即將與基質(zhì)類似的化合物(通常為共價鍵)結(jié)合到固定相上,再利用其特異的親和性沉淀與其對應(yīng)的特定的酶或蛋白質(zhì)。

2類別編輯

◆按層析的機(jī)理劃分:
吸附層析:利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異,達(dá)到分離鑒定的目的。
分配層析:利用不同組分在流動相固定相之間的分配系數(shù)不同,使之分離。
離子交換層析:利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。
凝膠層析:利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。
◆按流動相固定相的不同劃分:
氣相層析、液相層析。這兩大類層析是以流動相不同來劃分的。如同時區(qū)分流動相固定相,劃分為:氣固層析、氣液層析液固層析液液層析等。
◆按操作形式劃分:
柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等。
柱層析:將固定相裝于柱內(nèi),使樣品沿一個方向移動而達(dá)到分離。
紙層析:用濾紙液體的載體,點(diǎn)樣后,用流動相展開,以達(dá)到分離鑒定的目的。
薄層層析:將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層,以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。
以上劃分無嚴(yán)格界限,有些名稱相互交叉,如親和層析應(yīng)屬于一種特殊的吸附層析,紙層析是一種分配層析柱層析可做各種層析。

3基本原理編輯

層析須在兩相系統(tǒng)間進(jìn)行。一相是固定相,需支持物,是固體或液體。另一相為流動相,是液體或氣體。當(dāng)流動相流經(jīng)固定相時,被分離物質(zhì)在兩相間的分配,由平衡狀態(tài)到失去平衡到又恢復(fù)平衡,即不斷經(jīng)歷吸附和解吸的過程。隨著流動相不斷向前流動,被分離物質(zhì)間出現(xiàn)向前移動的速率差異,由開始的單一區(qū)帶逐漸分離出許多區(qū)帶,這個過程叫展層。
系數(shù)K是物質(zhì)在兩相中的濃度比。K值大,則在固定相中吸附牢,K值小吸附差。各物質(zhì)間的K值差別大,則易被分離。不同類型層析的K值含義不同,可視為吸附平衡常數(shù),分配常數(shù)離子交換常數(shù)等。
研究層析現(xiàn)象而發(fā)展的塔板理論,與有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的分餾法原理有些相似。被分餾的有機(jī)溶劑分餾柱內(nèi)的填充物上形成許多熱交換層,從而把低沸點(diǎn)溶劑先分餾出來,達(dá)到純化的目的。在層析時用理論塔板數(shù)n來衡量層析效能。
tR為物質(zhì)在層析柱上的保留時間,W為洗脫下來的物質(zhì)峰形的寬度。n值愈大表示層析柱的效能愈高。如用理論塔板高度H表示,則包含了層析柱長度的因子。
式中L為層析柱的柱長。H值越大,則柱效越低。
此外影響層析分離效果的還有渦流擴(kuò)散、縱向擴(kuò)散和傳質(zhì)阻抗等因素。因此選擇層析固定相支持物的粒度、均勻度等物理性能,流動相的層析系統(tǒng)和溫度等都是做好層析的關(guān)鍵。

4常用層析編輯

吸附劑的吸附力強(qiáng)弱,是由能否有效地接受或供給電子,或提供和接受活潑氫來決定。被吸附物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如與吸附劑有相似的電子特性,吸附就更牢固。常用吸附劑的吸附力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?a href=http://baike.baidu.com/view/145596.htm target=_blank>活性炭、氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最強(qiáng)。吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數(shù)吸附劑遇水即鈍化,因此吸附層析大多用于能溶于有機(jī)溶劑的有機(jī)化合物的分離,較少用于無機(jī)化合物。洗脫溶劑的解析能力的強(qiáng)弱順序是:醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳己烷等。為了能得到較好的分離效果,常用兩種或數(shù)種不同強(qiáng)度的溶劑按一定比例混合,得到合適洗脫能力的溶劑系統(tǒng),以獲得最佳分離效果。
在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相和有機(jī)溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等,這些親水物質(zhì)能儲留相當(dāng)量的水。被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解,但分配比率不同,展層時就會形成以不同速度向前移動的區(qū)帶。
支持物是人工交聯(lián)的帶有能解離基團(tuán)的有機(jī)高分子,如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。帶陽離子基團(tuán)的,如磺酸基(—SO3H)、羧甲基(—CH2COOH)和磷酸基等為陽離子交換劑。帶陰離子基團(tuán)的,如DEAE—(二乙基胺乙基)和QAE—(四級胺乙基)等為陰離子交換劑。離子交換層析只適用于能在水中解離的化合物,包括有機(jī)物和無機(jī)物。對于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團(tuán)在水溶液中解離后,能吸引水中被分離物的離子,各種物質(zhì)在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態(tài),各種離子有不同的交換常數(shù),K值愈高,被吸附愈牢。洗脫時,增加溶液的離子強(qiáng)度,如改變pH,增加鹽濃度,離子被取代而解吸下來。洗脫過程中,按K值不同,分成不同的區(qū)帶。
支持物是人工合成的交聯(lián)高聚物,在水中膨脹后成為凝膠。凝膠內(nèi)為內(nèi)水層,凝膠周圍的水為外水層??刂?a href=http://baike.baidu.com/view/1461879.htm target=_blank>交聯(lián)度以形成不同孔徑網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。交聯(lián)度小的孔徑大,交聯(lián)度大的孔徑小。凝膠只允許被分離物質(zhì)中小于孔徑的分子進(jìn)入,大于孔徑的分子被排斥在外水層,最先被洗脫下來。而進(jìn)入孔徑的分子也按分子量大小大致分離成不同的區(qū)帶。選擇不同規(guī)格的凝膠,可把一個混合物按分子量的差異分成不同的組分。這種方法曾被稱為分子篩。目前常用的凝膠商品有:葡聚糖凝膠(sephadex)、聚丙烯酰胺凝膠(bio-gel)、瓊脂糖凝膠(sepharose)和聚苯乙烯凝膠(styragel)等。
在一對有專一的相互作用的物質(zhì)中,把其中之一聯(lián)結(jié)在支持物上,用于純化相對的另一物質(zhì)。常見的親和對如:和抑制劑,抗原和抗體,激素受體等。支持物為瓊脂糖或纖維素等。
屬于分配層析吸附層析,僅適用于分析分離揮發(fā)性和低揮發(fā)性物質(zhì)。固定相是在惰性支持物(如磨細(xì)的耐火磚)上覆蓋一層高沸點(diǎn)液體,如硅油、高沸點(diǎn)石蠟和油脂、環(huán)氧類聚合物。外涂層約為支持物重量的20%。分析時操作溫度范圍,一般從室溫到200℃。特殊的層析柱能達(dá)到500℃。流動相常用氦、氬或氮為展層氣體。氣相層析分離的區(qū)帶十分清晰,是由于揮發(fā)性物質(zhì)在兩相間能很快達(dá)到平衡,所需分析時間大為縮短,一般為數(shù)分鐘至10余分鐘。檢測記錄系統(tǒng)繪出的各峰是測定流出氣體電阻變化的結(jié)果,因而測定樣品量可到微克和毫微克水平。具有快速、靈敏和微量的優(yōu)點(diǎn)。氣相層析也能用于分離制備樣品,但需增加將流出氣體通過冷凍將分離物回收的裝置。
濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質(zhì),能形成水相和展層溶劑的兩相系統(tǒng),被分離物質(zhì)在兩相中的分配保持平衡關(guān)系。紙層析用于分析簡單的混合物時可做單向?qū)游觥τ趶?fù)雜的混合物,可做雙向?qū)游?/a>。1944年A.J.P.馬丁第一次用紙層析分析氨基酸,得到很好的分離效果,開創(chuàng)了近代層析的發(fā)展和應(yīng)用的新局面。70年代以后,紙層析已逐漸為其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法,如離子交換層析、薄層層析、高效液相層析等所代替。
在玻璃片、金屬箔或塑料片上鋪上一層約1~2毫米的支持物,如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚酰胺等,根據(jù)需要做不同類型的層析。聚酰胺薄膜是一種特異的薄層,將尼龍溶解于濃甲酸中,涂在滌綸片基上,當(dāng)甲酸揮發(fā)后,在滌綸片基上形成一層多孔的薄膜,其分辨力超過了用尼龍粉鋪成的薄層。薄層層析較紙層析優(yōu)越在于分辨高,展層時間短。例如用紙層析做氨基酸分析,往往需要兩天時間,而且對層析條件要求嚴(yán)格,不易得到滿意的分離效果。如用薄層層析做,一般約需半小時,分離效果更好。薄層層析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制備樣品。
70年代新發(fā)展的層析法。其特點(diǎn)是:用高壓輸液泵,壓強(qiáng)最高可達(dá)5000psi(相當(dāng)于34個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓)。用直徑約3~10微米的超細(xì)支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一層1~2微米的二氧化硅,經(jīng)硫酰氯反應(yīng)生成Si—Cl,進(jìn)一步連接疏水的烷基,如Si—C18H37,或陽離子交換基團(tuán)—Si(CH2)n—C6H4SO3H,或陰離子交換基團(tuán)—Si(CH2)nNH2。這種支持物能承受很高的壓力,化學(xué)性能穩(wěn)定。用不同類型支持物的HPLC,可做吸附層析、離子交換層析凝膠過濾層析。其分析微量化可達(dá)10-10克水平。但用于制備,可以純化上克的樣品。展層時間短,一般需幾分鐘到10余分鐘。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適于分析分離不揮發(fā)和極性物質(zhì)。而氣相層析只適用于揮發(fā)性物質(zhì),兩者互為補(bǔ)充,都是目前最為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀,數(shù)據(jù)處理的積分儀和記錄儀等電子系統(tǒng),成為一種先進(jìn)的分析儀器,在生物化學(xué)、化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和環(huán)境科學(xué)的研究中發(fā)揮了重要作用。
吸附層析中,高極性物質(zhì)在層析柱上吸附較牢,洗脫時發(fā)生拖尾現(xiàn)象和保留時間長的問題。如果在支持物上涂上一層高碳原子的疏水性強(qiáng)的烷烴類,洗脫液用極性強(qiáng)的溶劑,如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強(qiáng)的物質(zhì)不被吸附,最先洗下來,得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反,故稱為反相層析。目前用HPLC做反相層析常用的ODS柱,即在支持物的表面上連接了C18H37Si—基團(tuán)。
核酸分析中,將樣品經(jīng)核酸酶部分裂解成不同長度的核苷酸片段,用同位素標(biāo)記后,在DEAE纖維素薄層上分離,用含有未標(biāo)記的相同的核苷酸片段作展層溶劑,這樣,未標(biāo)記的核苷酸把標(biāo)記過的核苷酸推進(jìn),使按分子量大小不同把標(biāo)記核苷酸片段,按由小到大的次序排列,達(dá)到分離的目的。于是把這種層析法稱為同系層析。同系層析和電泳相結(jié)合曾用于寡核苷酸的順序分析。
紙層析是層析法的一種,要了解紙層法還得從層析法開始.層析法又稱色層分析法或色譜法(Chromatography),是一種基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同,使它們在某種基質(zhì)中移動速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法。例如:我們利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學(xué)反應(yīng)等方面的差異,使其在流動相固定相之間的分配系數(shù)(或稱分配常數(shù))不同,達(dá)到彼此分離的目的。
層析法的最大特點(diǎn)是分離效率高,它能分離各種性質(zhì)極相類似的物質(zhì)。而且它既可以用于少量物質(zhì)的分析鑒定,又可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。因此,作為一種重要的分析分離手段與方法,它廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)上?,F(xiàn)在,它在石油、化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域都發(fā)揮著十分重要的作用。
層析根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類,層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。其中紙層析是指以濾紙作為基質(zhì)的層析。

5層析發(fā)展編輯

起步期

在層析技術(shù)發(fā)展之初,對于一些物質(zhì)的分離方式都處在比較原始的狀態(tài),并且分離的結(jié)果也并不是很理想。
  bio-rad專家談到層析技術(shù)最初是在1903~1906年由俄國植物學(xué)家M.Tswett首先提出來的。
  那時,他將葉綠素的石油醚溶液倒入碳酸鈣管柱,并繼續(xù)以石油醚淋洗,由于碳酸鈣對葉綠素中各種色素的吸附能力不同,所以色素被逐漸分離,在管柱中出現(xiàn)了不同的色譜圖。于是就稱這種混合物的分離方法為,有色的圖譜法(Chromato+graphy),簡稱色譜法,又叫層析法。不過,當(dāng)時這種方法并未引起人們的注意。
接下來隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及生產(chǎn)實(shí)踐的需要,層析技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展。這里就不得不提到兩位在層析技術(shù)發(fā)展史上做出重要貢獻(xiàn)的人,他們是英國生物學(xué)家馬?。∕artin)和辛格(Synge)。是他們首先提出了色譜塔板理論。
色譜塔板理論其實(shí)是基于熱力學(xué)近似的理論,這個理論中涉及的對象有目標(biāo)分離物,色譜柱。這里色譜柱好比是一個分餾塔。理論是這樣的:將目標(biāo)分離物倒入“分餾塔”,這樣就會在分餾塔板間移動,在每一個塔板內(nèi)組分分子在固定相和流動相之間形成平衡,隨著流動相的流動,組分分子不斷從一個塔板移動到下一個塔板,并不斷形成新的平衡。一個色譜柱的塔板數(shù)越多,則其分離效果也就越好。這個分離過程提升分離效率,并且定量的進(jìn)行描述,分析這個分離過程。
  這是個進(jìn)步,并且馬?。∕artin)和欣革(Synge)還提出更為遠(yuǎn)見卓識的預(yù)言:1、流動相可用氣體代替液體,因?yàn)榕c液體相比,分離時候,物質(zhì)間作用力更小,對分離也就更有好處。2、若能夠使用非常細(xì)的顆粒填料,并在色譜柱兩端施加較大的壓差,從而增加了理論培板數(shù),這將會大大提高分離效率。

發(fā)展期

上世紀(jì)60、70年代是色譜/層析技術(shù)快速發(fā)展的時代,首先是層析介質(zhì)有了飛速的發(fā)展,各種人工合成的介質(zhì)出現(xiàn),如硅膠、聚苯乙烯二乙烯基樹脂、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等樹脂或凝膠的出現(xiàn),極大地拓展了層析技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域和范圍,基于不同介質(zhì)的層析方法也如雨后春筍般不斷涌現(xiàn)。

現(xiàn)代層析法特點(diǎn)

色譜法或是層析法是簡單點(diǎn)說,就是依據(jù)被分離物的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同,使它們在某種基質(zhì)中移動速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法。[1] 
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