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革蘭氏染色

[ 更新時間:2014-06-09 ]
革蘭氏染色

編輯

 
革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法,1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。未經(jīng)染色之細(xì)菌,由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小,故在顯微鏡下極難觀察。染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對比,可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征,而用以分類鑒定。革蘭氏染色屬復(fù)染法。

中文名
革蘭氏染色
所屬學(xué)科
細(xì)菌學(xué)
發(fā)明時間
1884年
發(fā)明人
漢斯·克里斯蒂安·革蘭
結(jié)    果
呈紫色,呈紅色
是否有誤差

1方法簡介編輯

是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法,這種染色法是由一位丹麥醫(yī)生漢斯·克里斯蒂安·革蘭(Hans Christian Gram,1853年-1938年)于1884年所發(fā)明,最初是用來鑒別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關(guān)系。
未經(jīng)染色之細(xì)菌,由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小,故在顯微鏡下極難觀察
陽性紫色陰性紅色

  陽性紫色陰性紅色

。染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對比,可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征,而用以分類鑒定。
相關(guān)選擇
致病菌與抗菌藥選擇
革蘭氏陽性菌:葡萄球菌屬(主要是金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等)、鏈球菌屬(肺炎鏈球菌、草綠色鏈球菌、腸球菌等)、白喉桿菌、炭疽桿菌、破傷風(fēng)桿菌、蠟樣芽孢桿菌等,其中,金黃色葡萄球菌、腸球菌等為臨床重要等病原菌。
革蘭氏陽性菌通常對青霉素類、第一(或第二)代頭孢菌素、萬古霉素、克林霉素等高度敏感,但是因為抗生素的濫用,MRSA/MRSE、VRSA/VISA、PISP/PRSP、VRE等多重耐藥菌已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人類的生命,這些細(xì)菌感染時,可以考慮使用萬古霉素、共殺素(奎奴普丁/達福普?。?、利奈唑胺、達托霉素、泰利霉素、夫西地酸(建議與耐酶的青霉素類或利福平聯(lián)用)等。另外,CNS(凝固酶陰性葡萄球菌)等細(xì)菌也要引起足夠等重視。
革蘭氏陰性菌:埃希氏菌屬、枸櫞酸菌屬、假單胞菌屬(綠膿桿菌等)、莫拉菌屬(卡他莫拉菌等)、奈瑟菌屬淋球菌、腦膜炎雙球菌等)、不動桿菌屬鮑曼不動桿菌、羅菲不動桿菌等)、克雷伯菌屬(主要是肺炎克雷伯桿菌)、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬(痢疾桿菌等)、黃桿菌屬、變形桿菌屬、軍團菌屬、耶爾森菌屬、嗜NDM-1血桿菌屬(杜克雷嗜血桿菌、流感嗜血桿菌等)、產(chǎn)氣桿菌屬、霍亂弧菌、陰溝腸桿菌等。革蘭氏陰性菌在院內(nèi)感染中的細(xì)菌感染中占了大約65%,且大多菌株容易對抗菌藥物耐藥,產(chǎn)生“新德里金屬酶”()的絕大多數(shù)細(xì)菌都是革蘭氏陰性菌(主要是大腸桿菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯桿菌)。
革蘭氏陰性菌對第三代頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松等)、氨基糖苷類(慶大霉素、妥布霉素等)、抗假單胞菌屬的青霉素類(哌拉西林替卡西林、羧芐西林等)、多粘菌素等高度敏感,對頭霉素類和第二代頭孢菌素也較敏感,但是,MDR-AB/PDR-AB、PDR-PA等多重耐藥菌給臨床用藥帶來過很大的困難。多粘菌素、碳青霉烯類(亞胺培南美羅培南等)、替加環(huán)素等可以用于多重耐藥菌等治療,但要慎用,否則很可能會到無藥可醫(yī)的地步(綠膿桿菌和鮑曼不動桿菌的一些菌株甚至已經(jīng)對碳青霉烯類有耐藥性)。值得注意的是,頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、氧頭孢烯類(拉氧頭孢、氟氧頭孢等)對某些多重耐藥菌也有特效,比如產(chǎn)ESBLs或AmpC酶的菌株,可以考慮與其他抗菌藥物(磷霉素等)聯(lián)用,另外,多西環(huán)素和多粘菌素聯(lián)用時,幾乎對所有對細(xì)菌都有協(xié)同抗菌作用,也可考慮。
根據(jù)細(xì)菌的革蘭氏染色性質(zhì),可以縮小鑒定范圍,有利于進一步分離鑒定,以對疾病做出診斷。又由于各種抗生素的抗菌譜不同,革蘭氏染色尚可做為選用抗生素的參考。

2實驗方法編輯

步驟

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟,具體操作方法是:
1)涂片固定。
2)草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。
3)自來水沖洗。
4)加碘液覆蓋涂面染約1分鐘。
5)水洗,用吸水紙吸去水分。
6)加95%酒精數(shù)滴,并輕輕搖動進行脫色,20秒后水洗,吸去水分。
7)蕃紅染色液(?。┤?分鐘后,自來水沖洗。干燥,鏡檢。

原理

通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后,在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物,革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密,故遇乙醇或丙酮脫色處理時,因失水反而使網(wǎng)孔縮小,再加上它不含類脂,故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙,,因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi),使其仍呈紫色;而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差,在遇脫色劑后,以類脂為主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出,因此通過乙醇脫色后仍呈無色,再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染,就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
染色的差異主要是由于陰性與陽性細(xì)菌細(xì)胞壁的差異所引起的。
①革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁
G+細(xì)菌細(xì)胞壁具有較厚(20-80nm)而致密的肽聚糖層,多達50層,占細(xì)胞壁成分的40%~95%,它同細(xì)胞膜的外層緊密相連(圖2-9)。有的G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含有磷壁酸(teichoic-acid),也稱胞壁質(zhì)(murein),它是甘油和核糖醇的聚合物,磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸帶負(fù)電荷,它在細(xì)胞表面能調(diào)節(jié)陽離子濃度。磷壁酸與細(xì)胞生長有關(guān),細(xì)胞生長中有自溶素(autolysins)酶類起作用,磷壁酸對自溶素有調(diào)節(jié)功能,阻止胞壁過度降解和壁溶。
如果細(xì)胞壁的肽聚糖層被消溶,G+細(xì)胞成為原生質(zhì)體(protoplasts),細(xì)胞壁不復(fù)存在,而只存留細(xì)胞膜。除鏈球菌外,大多數(shù)G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含極少蛋白質(zhì)。
②革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁 G—細(xì)菌細(xì)胞壁比G+細(xì)菌細(xì)胞壁?。?5~20nm)而結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,分外膜(outer membrane)和肽聚糖層(2~3nm)(圖2-10)。在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜之間有一個明顯的空間,稱為壁膜間隙(periplasmic space)。
外膜 G—細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),它同細(xì)胞質(zhì)膜相同之處也是雙層類脂,但除磷脂外還含有多糖和蛋白質(zhì)。
LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重復(fù)分支的碳水化合物分子組成,含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖)和二脫氧已糖。由于糖的種類不同,使各種G—細(xì)胞具有不同特性的LPS。核心多糖(core polysaccharide)的主要組分是酮脫氧辛酸(ketodeoxyoctonate, KDO)。
外膜中還含有幾種蛋白,如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用(porin),調(diào)控外界分子進入細(xì)胞;有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體;許多G—細(xì)菌對高等生物有致病性是由LPS的成分決定的,它的毒性組分常稱為內(nèi)毒素(endotoxins)。
肽聚糖層 G—細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層很薄,在大腸桿菌和其它細(xì)菌中僅有單
層。肽聚糖層和外膜的內(nèi)層之間通過脂蛋白連接起來。
壁膜間隙 G—細(xì)菌細(xì)胞壁的外膜與細(xì)胞質(zhì)膜之間存在明顯的壁膜間隙,一層薄的肽聚糖處于其間,肽聚糖層和細(xì)胞質(zhì)膜之間的間隙較寬,肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12~15nm,呈膠胨態(tài)。其間含有三類蛋白質(zhì):水解酶,催化食物的初步降解;結(jié)合蛋白,啟動物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程;化學(xué)受體(chemoreceptors),在趨化性中起作用的蛋白。

染色結(jié)果

革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色。

3臨床意義編輯

其重要的臨床意義在于:1.鑒別細(xì)菌 2.選擇藥物 3.與致病性有關(guān):革蘭氏陽性菌能產(chǎn)生外毒素,革蘭氏陰性菌能產(chǎn)生內(nèi)毒素;而內(nèi)毒素主要是指革蘭氏陰性菌胞壁成分中的脂多糖,兩者的致病作用不同。

4特性編輯

革蘭氏染色屬復(fù)染法,即將標(biāo)本固定后,先用龍膽紫染色,加碘液媒染后用酒精脫色,再用蕃紅復(fù)染。染色后除可以看到細(xì)菌形態(tài)外,還可將細(xì)菌分為兩大類,即不被酒精脫色而保留紫色者為革蘭氏陽性菌(G+)。被酒精脫色復(fù)染成紅色者為革蘭氏陰性菌(G-)。革蘭氏染色原理尚不肯定,可能與細(xì)菌所帶核糖核酸、細(xì)菌壁結(jié)構(gòu)通透性、等電點等因素有關(guān)。致病菌如金黃色葡萄球菌、綠色溶血性鏈球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、碳疽桿菌等屬革蘭氏染色陽性菌。百日咳桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、霍亂弧菌、流行性腦膜炎雙球菌、淋病雙球菌等均屬革蘭氏陰性。

5鑒定原理編輯

革蘭氏染色

  革蘭氏染色

該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G-菌,是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G-菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì),而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低,故用乙醇丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì),增加了細(xì)胞壁的通透性,使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出,結(jié)果細(xì)菌就被脫色,再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高,類脂質(zhì)含量少,經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小,通透性降低,因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色,呈現(xiàn)藍(lán)紫色。
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